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リアルタイムPCRのスタンダードについて質問です。

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ID非公開さん

2017/3/2110:50:09

リアルタイムPCRのスタンダードについて質問です。

先日、先輩が作成したGAPDHとTNF-α(マウス組織から作製)のスタンダードを利用してリアルタイムPCRを行ったところ、スタンダードが全く測定できませんでした。

確認のため、それらのスタンダードを電気泳動にかけたところ、バンドは出ませんでした。
スタンダードは作製してから半年以内であると思うのですが、分解してしまったのでしょうか?


また、スタンダードを作製する場合のプロトコルなどあれば教えていただきたいです。

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h_erectus12さん

2017/3/2113:59:16

どれくらいの濃度で保存されていたはずなんだろうか?
>確認のため、それらのスタンダードを電気泳動にかけたところ、バンドは出ませんでした。
それはPCR前のことか後のことか?後ならばリアルタイムで検出できなかったんだから当たり前だし、前なら当然、見えるはずの量を乗せたんでしょうね?

そのスタンダードが実際のリアルタイムPCRにすぐ使えるくらい薄く希釈された状態だったなら、すぐにだめになります。それは保存チューブへの吸着ロスによって薄くなって濃度があてにならなくなったり、ほぼ完全に失われてしまうため(そのけっかなにも増えなくなる)です。

ストックは十分に高濃度で保存し、使用直前に希釈するのがよろしい。希釈液もただの水やバッファーだと吸着を防げないので、キャリアRNA, リニアポリアクリルアミド、BSA、界面活性剤などを含んだ希釈液を使用するのが常識。

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