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プラスミドを環状のままで電気泳動すると、3本のバンド(スーパーコイルド、オー...

num********さん

2008/11/519:26:31

プラスミドを環状のままで電気泳動すると、3本のバンド(スーパーコイルド、オープンサーキュラー、リニア)が現れたのですが、それぞれどういった状態のプラスミドなのですか?泳動距離との関係も含め教えて下さい

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nor********さん

2008/11/600:19:54

同じ大きさの輪ゴムをイメージしてください。

スーパーコイルは二本鎖DNAに切れ目が無い状態で、
輪ゴムがぐるぐると絡まった状態です。∞こんな感じです。

オープンサーキュラーは、二本鎖DNAの片方の鎖に切れ目(ニック)が入って、
ただの円状の輪ゴムです。○こんな感じ。

リニアは、二本鎖DNAが完全に切れて、直鎖になった状態です。
輪ゴムを切って、一本のゴムひもになった状態です。-こんな感じ。

さて、元が同じ大きさの輪ゴムでも、
絡まった状態(スーパーコイル)と、
普通の状態(オープンサーキュラー)と、
ゴムひもになった状態(リニア)とでは、長さが異なりますよね。

電気泳動では、長さが短いものほど良く流れ、
長いものほど、流れにくくなります。
ですので、リニア状が最も流れにくくなります。
オープンサーキュラーとスーパーコイルは
泳動条件により、どちらが良く流れるとは一概に言えないようです。
確かなのは、最も流れにくい(大きいサイズ)バンドがリニアのプラスミドだと言う事です。

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h_e********さん

2008/11/1111:38:54

スーパーコイル (ccc, covalently closed circular, 共有結合で閉じた環状)を精製しても、どうしてもある程度はnick(DNAの切れ目、ヌクレオチド間の共有結合の列断)が入るのでオープンサーキュラー(OC)やリニア(線形)が生じます。
cccは環状二本鎖にnickが全くないだけでなく、ある酵素(トポイソメラーゼ)で巻き上げられた状態です。この酵素は、環状二本鎖の鎖を一旦切断して、断端をぐるっと回転させてまたつなぎなおします。そうすると二本鎖の対合は保たれたまま、プラスミド分子全体が超らせん(プラスミド環をぺしゃっとつぶしてねじり上げたような状態)になり分子の占める体積(ファンデルワールス体積)が小さくなります。

ヌクレオチド間の共有結合はある頻度で自然に切れnickを生じます。どこか一箇所でも、片方の鎖でも、nickがあると超らせんの状態をつなぎ止めておけないのでOCになります。nickはランダムに生じますから、たまたま二本鎖の両方で同じ場所にnickが入れば、二本鎖が切断され線形になります。

同じ分子量のDNAであれば、ファンデルワールス体積の小さい方が移動度が高いので、cccが一番早く移動します。OCと線形ではOCの方がファンデルワールス体積が大きいので、通常、OCのほうが若干移動度がひくいです。ただし、これは泳動条件(EtBr共存下か否かなど)で変わることもあるようです。

ter********さん

編集あり2008/11/722:39:35

おっしゃっておられることが変なのですが、どうして“プラスミドを環状のまま”電気泳動したのに、“リニアが現れた“りするのですか? ”環状のまま“と言うのが書き間違いで、何か処理をしたものを流しているのですか?
それとも、要するに大腸菌からとってきたプラスミドを電気泳動したらバンドが3本でたので、この3本はそれぞれ何者かと言うことなのでしょうか? もしそうなら、その内の1本がリニアだと思った理由はなんなのですか?そもそも 普通にプラスミドをとってきて(よほどのへまでもしたらわかりませんが)、リニアが見られるることはないですよ。
状況をもう少し詳しく教えてください。

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