ここから本文です

リアルタイムPCRのベースラインに関する質問です。

man********さん

2020/2/2800:14:50

リアルタイムPCRのベースラインに関する質問です。

ROXなしのインターカレーター法で行っているのですが、増幅曲線が立ち上がる前、いわゆるベースラインが水平ではなく、緩やかに右肩上がりにドリフトするものがあります。

こういうサンプルは、Efficiencyが低めになってしまいます。

この原因について何か示唆していただければ幸いです。

よろしくお願いいたします。

閲覧数:
14
回答数:
1
お礼:
50枚

違反報告

ベストアンサーに選ばれた回答

gem********さん

2020/2/2909:23:21

インターカレーター法のリアルタイムPCRでベースラインが上がるのは、
非特異反応が起こっている可能性が考えられます。
ただし、一方のプライマーのみの増幅なので、指数関数的な増幅は起きず
サイクル毎に一定の比率でベースラインが増加します。
このような場合は、Efficiencyが低くなってしまいます。

  • 質問者

    man********さん

    2020/3/223:17:35

    回答ありがとうございます。

    プライマーダイマーができているのかと思い、リアルタイムPCR後にアガロース電気泳動で確認したのですが、プライマーダイマーと思われるバンドがなかったので、プライマーに由来するものではないのかと思っていました。

    インターカレーター法のでは、片方のプライマーだけの非特異的増幅でも影響が出るのですね。
    確かに、4倍希釈したものでも、NTCでも同じような傾きで増幅曲線がドリフトしていきました。

    このような場合の対策としては、プライマーの変更が一番確実でしょうか?

    リアルタイムPCRの解析ソフトにもよるのでしょうが、たとえば、NTCの増幅曲線を差し引いてから、Ct値やCq値を求めるということもできるのでしょうか?

    よろしくお願いいたします。

返信を取り消しますが
よろしいですか?

  • 取り消す
  • キャンセル

質問した人からのコメント

2020/3/4 12:29:19

回答いただきまして、ありがとうございました。

複数のプライマーを組み合わせてqPCRしたところ、アドバイスいただきましたように、片側のプライマーを変更することでベースラインのドリフトが改善される現象を確認しました。

良い勉強になりました。

みんなで作る知恵袋 悩みや疑問、なんでも気軽にきいちゃおう!

Q&Aをキーワードで検索:

Yahoo!知恵袋カテゴリ

一覧を見る

Yahoo! JAPANは、回答に記載された内容の信ぴょう性、正確性を保証しておりません。
お客様自身の責任と判断で、ご利用ください。
本文はここまでです このページの先頭へ

「追加する」ボタンを押してください。

閉じる

※知恵コレクションに追加された質問は選択されたID/ニックネームのMy知恵袋で確認できます。

不適切な投稿でないことを報告しました。

閉じる