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DNA純度について

ant********さん

2009/6/1723:09:55

DNA純度について

吸光度によるDNA純度の確認についてですが、260/280が1.8程度、260/230が2.0程度が純度が高いということですよね。
私のつたない知識では280がタンパクの吸光度、230がタンパクやフェノール類の吸光度を示していると理解しております。
つまり、260/280や260/230の値が低い場合はタンパクのコンタミが疑いがあるものだと考えております。
それでは260/280や260/230の値が高い場合にはどのように解釈すればよろしいのでしょうか?
また260/230が正常で260/230の値が低い場合はフェノールなどのコンタミと考えればいいのでしょうか?
どなたかご回答のほどよろしくお願いいたします。

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ron********さん

2009/6/1818:15:48

DNA、RNA、タンパク質、フェノール、緩衝液、などはそれぞれ特有の吸光スペクトラムを持っています。

核酸
http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/FG06_055.GIF
タンパク質
http://www.microbiology.emory.edu/altman/images/ProteinSpectrum.gif
フェノール
http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/phenol.html

260nmあるいは280nmの波長に対してだけ吸光度が示される訳ではなく、連続的にどの波長に対しても、それぞれ一定の割合で紫外吸光が示されるものなので、そこから純粋な溶液である場合の理論値が推定される訳ですね。この理論値に近いほど純度が高く、離れるほど純度が低いということになります。この中で核酸純度の検定に260, 280, 230nmの波長がよく用いられるのは、

260 核酸の吸光度が極大を示す
230 核酸の吸光度が極小を示す
280 タンパク質の吸光度が極大を示す
http://matcmadison.edu/biotech/resources/methods/labManual/unit_4/e... Table1を参照してください)
ためであり、検出感度を高めて核酸抽出および精製過程で生じるコンタミに気付き易いように設定されたものです。端的には以下の要因を確認しています。
260/230 ratio = Organic chemicals and solvent contamination
260/280 ratio = Protein Contamination
http://ricfacility.byu.edu/Nanodrop.html

260/280が正常で260/230の値が低い場合は、溶液中の塩濃度が高いために230値が上がっている、RNAの比率が高かったりフェノールが残留していたりなどの理由で260/280値が実際より高く見積もられている、といったケースが考えられそうですが、230nmの吸光度は、上で参照して頂いたリンク先のTableにもあるように、緩衝液組成など、様々な要因によって容易に変動するものですので、実際の実験系で適切な範囲を確認することが大切かと思います。

以下のページも参考にしてみてください。
Quantification of nucleic acids - Wikipedia, the free encyclopedia
http://en.wikipedia.org/wiki/Quantification_of_nucleic_acids
RNA quality control
http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html

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h_e********さん

2009/6/2116:10:58

280 nmはタンパク質の吸光ですが、230 nmは主に多糖類です。ポリフェノールも230 nmのようです。植物を材料にした場合、多糖類やポリフェノールが大量にコンタミすることがあるみたいです。動物でも肝臓などグリコゲンの多い組織だと多糖類がかなり入ってきます。
http://www.springerlink.com/content/x03jup2wt2502847/

核酸の吸光度はpHに大きく影響を受けますので、適当なバッファーで希釈したもので測定しなければなりません。蒸留水を使っているようだと測定値もratioも狂います。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9067025

260/280などのratioは、値が低い場合は「あきらかに」純度に問題があるということが示されるに過ぎず、そういう目的でつかうものです。この方法ですべての不純物が検知できるわけではないし、値が高いことで純度の高さが保証されるというものではないので、値が高い場合はそれが何を意味するかとか、有用な情報はないと考えてください。

bri********さん

2009/6/1903:44:11

260nm/280nm比は1.8以上でも2.0前後までなら問題ないよ。純度が高いって事。

260nm/230nmは1.8より大きければ問題ない。供雑物はフェノールには限らないよ。ペプチド類とか。

バッファーがどうのって書いてあるが、普通は使ったバッファーでブランクを取るから、あんまり関係ないんだがね。

http://www.beckmancoulter.co.jp/anote_dload/CEQ_DNA.html

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