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cDNAをRT-PCRによって増幅するとき、ネガティブコントロールでcDNAのもとになった...

got********さん

2010/1/1100:55:23

cDNAをRT-PCRによって増幅するとき、ネガティブコントロールでcDNAのもとになったRNAにDNAが混合しているかどうかを調べるとします。このDNAが混合している恐れのあるRNA溶液をPCRすると、RNAは増幅しますか?

簡単にいえば、RNAはPCRによって増幅しますか?

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lar********さん

2010/1/1321:17:12

RNAは増幅しませんよ。

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am8********さん

2010/1/1120:47:42

普通は、最初のRNAにDNAがコンタミしているのを心配して、逆転写酵素なしのコントロールを作ると思うのですが・・・

bes********さん

2010/1/1102:57:52

RTase活性のあるDNA polymeraseでPCRすれば、DNAのコンタミがなくても増えるでしょう。
しかし、現在一般的にPCR用として市販されているDNA polymeraseだったら、アガロースゲル電気泳動でバンドとして認識されるほどは逆転写からの増幅は起こらないと思います。
バンドが確認されるとすれば、そのRNA溶液にDNAがコンタミしているということになります。

リアルタイムPCRだとどの程度検出されてしまうかはわからないです。
以前、DNase処理をどれだけしても、増幅されてしまうと困っている人を見たことがあります。その時その人が使っていた酵素はちょっと特殊だったので、そのせいかもしれません。

いずれにせよ、万が一ネガコンで何かが増幅してしまった時に備えて、イントロンを挟むようにプライマーを設計し、ネガコンでの増幅産物がRNA由来の断片(イントロンなしの長さ)か、ゲノム由来の断片(イントロン込みの長さ)かの判断ができるようにすると便利です。

というか、ネガティブコントロールの意味を理解していますか?
RNAがPCRで増幅する前提だったら、RNAをテンプレートにしたPCRがネガティブコントロールにならないんじゃないですか?

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