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大学でオワンクラゲの形質転換の実験をしたんですが課題が出て分からないので教え...

kar********さん

2007/10/1723:23:33

大学でオワンクラゲの形質転換の実験をしたんですが課題が出て分からないので教えてください。①大腸菌を使ったんですが、大腸菌の中にGFPが発現するために必要な条件を2つあげて理由を説明する。

http://www.yamagata-c.ed.jp/kyouka/rikanoheya/kouza/seminar/semi1.h...のpGLOの図のベクターを使って大腸菌に緑色の目的タンパク質をつくりたい時、LB/amp/araの条件で実験を行った。どの制限酵素サイトに導入が可能か説明する。面倒くさいかもしれませんが、詳しく解答お願いします。

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ベストアンサーに選ばれた回答

suf********さん

2007/10/1811:12:29

大腸菌にオワンクラゲ由来のGFPタンパク質をpGLOベクターを用いて発現させるという実験でしょうか?

まず①ですが、そもそも大腸菌の中にはGFPをコードしている遺伝子がありません。そのため、外から遺伝子を導入してやる必要があります。そこで遺伝子の運び屋であるベクター、この場合はpGLOベクターを用いて形質転換をすることによってGFP遺伝子を大腸菌に導入してやります。ベクターが導入されていない大腸菌はアンピシリン存在下の培地では生育できないので、生じたコロニーにはベクターが導入されていることになります。次にその遺伝子発現を調節する機構が必要になります。pGLOベクター中にはaraC遺伝子が入っており、これはリプレッサーとしてGFP遺伝子上流にあるPBAD領域に結合し、遺伝子の発現を抑制しています。しかしこのタンパク質はアラビノース存在下ではその働きを失い、遺伝子が発現することになります。

したがってamp/ara存在下でGFP遺伝子が発現することになります。

私はこの系を用いて実験したことがありませんが、発現が抑制されている場合にも微量のタンパク質が発現していることもあります。もしアラビノース非存在下でも大腸菌が緑色に光っていたら、その可能性があります。

次に②ですが、「緑色の目的タンパク質」というのは「GFPが融合した目的タンパク質X(GFP-X)」をLB/amp/araを含む培地で大腸菌に作らせるという解釈でよろしいでしょうか?結論から言うと「作製できない」となるのですが、順を追って説明します。

まずどの制限酵素サイトを用いるかですが、ベクターの図を見るといくつかの制限酵素サイトがあります。NdeIとHindIIとEcoRIです。NdeI、HindIIIで切断すると両酵素とも2箇所の制限酵素サイトがあります。NdeIで切断するとベクターの大半を失うことになり、HindIIIで切断するとGFP遺伝子の半分以上を失うことになります。したがって、どちらも不適切です。唯一可能性があるのはEcoRIで、ここに遺伝子を導入するとGFP遺伝子の下流にあり一見すると大丈夫なように見えます。しかし厳密にはGFP遺伝子の終始コドンの直後にEcoRIの認識配列が続くので、EcoRIで切断したベクターにいくら目的の遺伝子を導入してもGFPが発現するのみです。これはpGLOの配列を調べないと分からないことなので、ここで挙げられた図だけから結論を導くのは不可能です。この図から言えることは、

EcoRIで導入が可能のように思えるが、EcoRI認識配列がGFP遺伝子の終始コドンの前にあるか後ろにあるかがこの図だけでは分からない。仮に前に存在するならばGFPタンパク質の構造に影響を与えないアミノ酸配列になるという条件で目的タンパク質が得られる。逆に後ろに存在するならGFPだけが発現するのみで目的タンパク質は得られないことになる。

というのが解答になると思います。まぁ、学生実習でpGLOの全塩基配列を調べ、GFP遺伝子の終始コドンの位置と制限酵素のサイトをわざわざ調べてレポートを書く学生さんは稀じゃないかと思います。

参考
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucl...
名前は異なりますが、同一のベクター配列です。GFP遺伝子をコードしているのは1342番目のatgから2061番目のtaaまでです。その直後にEcoRI認識配列であるgaattcがあります。

ベストアンサー以外の回答

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brd********さん

編集あり2007/10/1811:33:55

①転写、翻訳、プロモーター、ORF、ori、マーカー遺伝子、araによる誘導、大腸菌、培地、培養温度、酸素
あたりから2つ
理由を付けると、
温度:大腸菌が死ぬ温度だとGFPは発現しない
大腸菌:大腸菌がいないとGFPは発現しない

②おそらく質問はGFP融合タンパク質を作る時に使える制限酵素サイトだと思います。
ベクターマップにわざわざ書かれているのでおそらく、NheI、EcoRI 
EcoRIが使用可能であれば、Sac I, Kpn I, Acc65I, XmaI, SmaI, BamHIも使えるはず。

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