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SDS-PAGEについての質問です。 1.5MTris-HCl(pH 8.8)を新しく作り直してから泳動...

voe********さん

2015/9/1615:16:33

SDS-PAGEについての質問です。
1.5MTris-HCl(pH 8.8)を新しく作り直してから泳動のパターンがおかしくなり、その原因が全くわかりません。

状況としてはゲル版の5mm上程度で電圧を止めた時、泳動の目安となるdyeの青色のすぐ上に48kDaのマーカーのラインが見えるような状況で、以前までは17kDaのマーカーのラインがそこにはありました。

作製法としてはごく一般的なもので100mLのスケールで作っており、Tris粉末18.15gを溶かしています。また5M HClでpHをあわせるときも中和熱等による発熱も考慮して氷を用いて冷やし、pHメーターの標準液と同じ温度(25℃)の時にpH8.8になるように調製しました。
またpHメーターの電極が古くなっていたことも考慮して、pH試験紙を用いて以前のものと色を比較してみても目立った色の変化は見られませんでした。

さらに分離ゲル作成時のSDSやAPS、TEMEDに問題ないことは確認しています。

以上を踏まえてpH、その他の試薬、Tris粉末の量等の一般的な事項は検証しましたが原因がわからず、本気で困っています。

なるべく具体的な回答をお願いします。よろしくお願いします。

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ベストアンサーに選ばれた回答

cre********さん

2015/9/1703:02:00

SDS-PAGEで低い分子量が観測できないということは、Monomer Solution(AcrylamideとBisacrylamideの混合溶液です。)の濃度が低すぎるからです。基本的に17 kDaを観測したいのなら12%以上を使います。48 kDaが下限ということは、7~8%以下になっているのではないかと思います。

これには、1.5 M Tris-HClは影響しませんが、計算などその他の条件が正しいとすると以下のような原因が考えられます。

SDS-PAGEが古い。
SDS-PAGEは数週間もすると濃度がポリマーの濃度が下がっていきますので、だんだんと低い分子量が観測できなくなっていきます。

Monomer Solutionが古い。
Monomer Solutionは光を避けて4℃で3ヶ月ほどもちます。それ以降でもSDS-PAGEを作ることはできますが、同じ分量で作っても濃度が低くなっていきます。

APSが古い。
APSは不安定ですので基本的にSDS-PAGEを作る直前に水に溶かします。これも同じようにポリマーの生成量が小さくなり濃度が低くなります。

見たところ、Monomer Solutionに問題があるように感じます。Monomer Solutionを新たに作り直して、濃度を計算しなおしてみてはいかがでしょうか。

ではでは。

  • 質問者

    voe********さん

    2015/9/1719:51:19

    回答ありがとうございます。

    いくつか質問があるのですが答えてもらえますか?
    1,どうして以前の1.5M Tris-HClでは8%のゲルで17KDaのマーカーがちゃんと見えるまで分離できていたのでしょうか?2〜3日に1回は泳動しているため短期間でMonomer Solutionが劇的に濃度が低くなった、とは考えにくいのですが・・・。

    2,SDS-PAGEとはどれのことを指すのでしょうか?固めたゲル板のことですか?SDS-PAGEが指すものとは電気泳動のことですよね?

    3,Monomer Solutionは某社の製品を使っているのですが、濃度はどのように調べて対応すればいいのでしょうか?

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質問した人からのコメント

2015/9/18 16:05:48

お二方ともかなり具体的な回答を頂きありがとうございました!!
ベストアンサーには原因を考える決定打を頂いたcre_littleさんとさせてもらいます。
結論としては、1.5M Trisで作製ごとに泳動パターンの誤差が生じること、Monomer Solutionの状態、APSの状態などが原因であったと思います。
今後は試薬の状態に合わせて分離ゲルの濃度を調節して対応していきたいと思います。

ベストアンサー以外の回答

1〜1件/1件中

ben********さん

2015/9/1617:25:16

ほかの試薬がおかしくないなどの確かめ方が確実かどうかは別にして

私の使用していた時はTris-HCLにSDSが入っていました。

SDSは入っていますか?

返信を取り消しますが
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