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こんにちは、生物系の研究室の学生です。組み換えDNA作成の実験で問題が発生したた...

phi********さん

2017/8/1700:20:41

こんにちは、生物系の研究室の学生です。組み換えDNA作成の実験で問題が発生したため、ご助言いただければと思い質問させていただきました。

現在、遺伝子組み換え大腸菌作成のため、タンパ

ク質発現用のプラスミドにORFを組み込む実験を行っています。
手法としてはライゲーションで作成したプラスミドを大腸菌に組み込んでアルカリ法で取ってくるというもので、 目的のプラスミドが作成できたかどうかを確認するためにPCRと制限酵素処理を行っています。

しかし、ここからが問題で、PCRで確認した時は目的のバンドが出てくれるのですが、制限酵素処理を行った時、ベクターのバンドのみが現れ、ORFのバンドが出ないという予期せぬパターンで観測されるのです。
この場合どのような原因が考えられるでしょうか、ご助言いただければ幸いです。

補足本日研究室のボスと議論をしてみて、コロニーPCRでバンドが増えたのは大腸菌をまいた際に駅中に残っていたORFを拾ってPCRをしており、大腸菌に組み込まれたのは2量体化したベクターだったためORFのバンドが見えなかったのだという結論に至りました。
明日検証実験を行う予定なのですが、ベクターのみがつながれたものが導入されるといったことは本当に起こりうるのでしょうか。また、起こるとすればどういった条件の時でしょうか。

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ベストアンサーに選ばれた回答

pla********さん

2017/8/1708:10:03

通常、コロニー選抜はPCRでの確認だけで十分だと思います。
後はシークエンス解析を行って配列を確認したほうが良いでしょう。

なぜ、予期せぬパターンになるのかについては細かい条件がわからないので何とも言えません。

PCRの条件は?
どの位置にプライマーを設計してバンドが確認できているのか。

制限酵素処理が問題なく行われているのでしょうか?
切れることのわかっているベクターに対して処理してみる。

制限酵素の位置は?
その制限酵素処理というのは元のベクター上にある配列、それともORFとして導入した配列なのか。

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質問した人からのコメント

2017/8/19 00:33:47

みなさん多数のご回答ありがとうございました
生成したプラスミドをPCRにかけてみたところバンドが一切出ませんでした
また、制限酵素処理で2つの制限酵素を用いていたのですが、それを1つにした場合ベクター×2の大きさの箇所にバンドが出ていたため、ボスの言う通りになっていたのかなと考えました。

ベストアンサー以外の回答

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jim********さん

2017/8/1812:30:05

PCR: PCRのプライマーは、ベクター配列を認識するものですか?もしそうであれば、ORFが入った場合はORFのバンドが確認され、入って無い場合は、短いバンドが確認されるはずです。
また、そのような設計であれば、残ってたORFには反応しません。
2量化: 制限酵素処理してないプラスミドを流せば、2倍なのかは確認できると思います。
制限酵素: おそらく両はしを切断するために2種類の制限酵素を使っていると思います。一つずつ切ったものを電気泳動で切断されているか確認したほうが良さそうですね。
私見: おそらくライゲーションはできていで、制限酵素処理でどちらか一方しか切断されてない。もしくは両方切断されてないのかな。と思われます。コントロールを置いて、きちんと確認したほうが良さそうですね。

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mad********さん

2017/8/1709:14:27

PCRは、ベクターに組み込まれたORFだけが増えるように設計していますか?それとも、ORFだけでも増えるような設計ですか?

後者なら、コロニーPCRでプレート上のORFフラグメントをそのまま増やしたか、試薬等を貴方が汚染させてそれが増えているのでは。

何をネガコンとしていて、ネガコンの結果がどうなっているのかを確認しましょう。

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マロンさん

2017/8/1704:12:25

yahoo知恵袋なんかじゃなくて、教授かマスターの先輩にでも聞いたほうがいいのでは?
そういう研究室内でのコミュニケーションも大切だと思いますよ

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