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環状DNAを制限酵素で切ったとき、すぐ直鎖状になるのですか?

chi********さん

2018/7/2400:47:00

環状DNAを制限酵素で切ったとき、すぐ直鎖状になるのですか?

今、生物を勉強しているのですが、制限酵素で切った環状DNAを電気泳動するとリニアが生じますよね。そしたら、クローニングの際に環状DNAは制限酵素が切れてそこに目的DNAがライゲーションされるまでどの状態で存在しているのですか?環状(環状が緩まった状態)ですぐに反応がおこるのですか?それとも直鎖状でそこから環状に戻るのですか?
もう一つ質問として、ニックが生じるとすぐ一本鎖の環状DNAとなるのですか?どこかのサイトで片方の鎖にニックが生じると環状DNAは一本鎖になると書いてありました。また、QuikChange法ではニックを形質転換させて無くすとありました。このときQuikChange法で形質転換させる前に一本鎖になったりしないのですか?
すごく初歩的な質問ですが、悩んでおります。ご教授お願いします。

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kos********さん

2018/7/2800:31:43

質問になってないですね。

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iwa********さん

2018/7/2507:27:55

DNAは環状の方がリニアよりは安定です。それはリニアだと末端から切られてしまうことがあるからですが、生体内で様々な酵素が存在する場合の話です。精製してコンタミのない環境ではどちらも安定して存在します。制限酵素で切ってリニアを生じて、それを電気泳動で観察できるということはリニアの状態で存在しているということです。

ライゲーションはリガーゼという酵素が行います。切れている末端をつなぐ酵素です。つまりリガーゼがない状態で自然につながるということはありません。

そして、一方だけにニックが入っても、片方が環状のままなら、相変わらず環状の二本鎖DNAです。このDNAを熱変性させて二本鎖をバラバラにすれば、ニックの入っている方のDNAは当然リニアになります。

QuikChange法ではニックの部分を修復しない(つながない)ままで形質転換しています。二本鎖の環状は保たれているので影響はないという考えだと思います。そして大腸菌内でつながれれば問題ないということです。

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