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いつもありがとうございます。今回は制限酵素が2種の場合の質問なのですが・・・・...

iru********さん

2011/6/2914:24:45

いつもありがとうございます。今回は制限酵素が2種の場合の質問なのですが・・・・。使う塩基配列は先ほど質問したものと同じでMus musculusのCDS領域197から775をクローニングしたいのですが、

下記URLのベクターでクローニングします。そのときに選ぶ制限酵素はSal1とBamH1と習いました。CDS領域が197から775で、197はatgcagではじまります。そこで数点質問なのですが

①この塩基配列の認識部位のない制限酵素に上記2つの制限酵素がはいっており、さらに、MCS部位にこの二つの制限酵素がありましたので、この二つの酵素を用いるという考え方でよろしいのでしょうか?

②この場合先ほど質問した1種類の制限酵素BamH1だけではだめなのでしょうか?

③クローニングの仕方ですが、まずPCRで複製をするところで、197の前にaaaとSal1のGTCGACをプライマーとしてつけて、aaagtcgacatgcag・・・を5’プライマーとし、3’プライマーとして、BamH1のGGATTCのあとにaaaをつけて複製ということでした。そのあとどこをどうやって、このベクターの中に挿入するのでしょうか?ベクターのSal1とBamH1の間を切り捨ててひっつけるということでしょうか?

わかりにくくて申し訳ございません。お手数おかけして申し訳ございませんが、ご教授願えたら幸いです

http://www.clontech.com/images/pt/PT3974-5.pdf#search='pmCherry'

補足早速のご回答ありがとうございます、今から本を取り出してしばらく考えてみます、いろいろご丁寧にありがとうございました。

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ベストアンサーに選ばれた回答

aka********さん

2011/6/3003:41:03

A①
その理解でよいかと。
他に同じ条件を満たす酵素があるなら、色々な組み合わせを考えても良いと思います。


A②
insertも入るでしょうが、BamHIで切ったvectorのself ligationが増えるかと思います。
BamHIで切ったvectorをさらにphosphatase処理して、、、という手間をかけてself ligationを減らしても、
発現vectorに入れる場合ですと、意図した向きに入るかどうかという面倒がさらに待ってます。

A③
定性的には、その理解で良いかと。
十分量のvectorをBamHI, SalIで消化しておきましょう。
入念にいきたいのなら、ゲルに流して切り出しまでしておくと、insert+のplasmidが取れやすいでしょう。

具体的に「ひっつける」のはligationのkitなどでやるのが簡便かと。
軽視する方もおられるようですが、vector:insertの比に留意されることをお勧めします。

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ベストアンサー以外の回答

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uni********さん

編集あり2011/6/3008:17:29

不明な点は、またどうぞ。
基本、kit に頼る必要がないだけの知識をおつけになる事をお勧めします。

図などの資料があって、それを指し示しながら言葉で解説すれば、すごく簡単な事なのですが、まどろっこしいですね文章は(制限もあるし)

まず、前提です
前回のが pGEM 系(バクテリア発現系)で今回のが pm でCMV promoter 系(ほ乳類細胞発現系、まあ私なら訳あってこのvector は選択しないと思いますが)なので、前回の construct があれば、ちょっとした操作でサブクローニングできるのですが、今回のは PCR からやり直すと言う事なのですね。
それから②の回答にもなるのですが、1種類で切断してクローニングすると、「向き」が限定できないのです(理由はお分かりだと思います)。ですから、前回の construct 集団の、理論的には半分は、目的遺伝子を発現しない向きに挿入されます。

さて、
①前回も書きましたが、習ったと言われる制限酵素を選択しなければ「ならない」理由はありません。CDS に切断部位がなく、(今回は)求める向きに挿入できるようなMCSの制限酵素サイトの並びになっていて、flame を合わせられればどういう組み合わせでも選択できます。ですから、あなたの先生がそれを例として勝手に選んだだけです。他にも組み合わせは考えられますので、ご自分で考えてみて下さい。

②BamH1だけでもいいですが、向きが限定したかったのでしょう。それなら2種類を選択します(当然、突出末端が違うものを選択します)。突出と平滑の組み合わせは避けた方がよいです。ligation 効率が違いすぎて、予期せぬ結果を招く事があります(例では BamH1-Sal1 でどちらも4nt 突出なので全く問題ありません)。

③pmCherry-N1は発現に CMV promoter を組み込んであるので、CMV の下流に正しい向きで目的の insert を入れる必要があります。MCS の site map を見て下さい。Sal1 site が上流、BamH1site が下流にあります。従って、PCR 時には、5'-側に Sal1 site を付加し、3'-側に BamH1 site を付加してやる必要があるのはお分かりだと思います。先日も説明した通り、制限酵素認識配列だけではなく aaa が余剰に付加してある理由はお分かりだと思います。forward primer はこれでいいのですが、reverse primer の設計に2点ほど考えることがあります。まず、reverse primer は 相補鎖側の逆向き配列をしていなければなりませんので BamH1 の配列 GGATCC の相補鎖 CCTAGGの逆の GGATCC に aaa を付加と考えて下さい(制限酵素認識部位はパリンドローム配列なので「結局は同じ」なのですが、考え方としては PCR 法の基本どおりに考えるようにしたほうがよいです)。二つ目ですが、このベクターは C-末に mCherry をつなげた形で発現させるところに特徴があるので(先日のベクターは N-末に tag をつけるものだった)、insert に termination codon があると、mCherry の前で転写が終わってしまいます。したがって insert の termination codon の一つ前の codon にflame をmCherry に合わせた形で BamH1 配列を付加するプライマー設計にする必要があります(もちろん mCherry がいらなければ term が入ってもいい)。
insert 用の PCR 産物とヴェクターの処理ですが、それぞれ別系統で BamH1, Sal1 で double digest します。この2つの制限酵素は至適 buffer 系と処理温度が同じなので(このこともこの2つを選択した理由の一つだと思います)、同時消化が可能です(制限酵素はバッファーが合っていないと star sctivity というのを発揮して、認識部位以外を消化してしまいます。用いる2つの制限酵素の至適バッファーが違う場合は、2段階に分けてそれぞれの酵素で消化します)。以上で、insert がわも vector がわも、目的の塩基突出ができているので、精製したら vector/insert 比を計算して混合し ligase でつなげます。

余談をいくつか・・・
pmCherry の制限酵素地図の末尾に Kozak sequence というのが書いてあります。これは下流の遺伝子を発現させるために入れてあります(字数の関係で、詳しい説明は省略)。
遺伝子操作は、step ごとに電気泳動や sequencing などで、それまでの手順がうまくいっている事を確認しながら次に進みます。今回ここまで説明した中でも、泳動で確認する step が何カ所かありますが、説明は省略しました。
この操作で construct が得られて、これをほ乳類細胞などに transfect するはずですが(でなければ、こいつを作る意味がない)、その段階および transfect 後の selection や assay にも多くの技術や注意点などありますが、課題の演習(や、この質問)とは離れますので省略します。

先ほども書いた通り、必要に応じてリクエストして下さい。
また、今回の回答でわかりにくい点があれば、まず、自分なりに考えてみてから補足して下さい。

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