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制限酵素の塩基配列認識というのはどれくらい厳密なものなのでしょうか?以前、8...

けいさん

2011/8/1111:55:58

制限酵素の塩基配列認識というのはどれくらい厳密なものなのでしょうか?以前、8塩基認識の制限酵素(NotⅠ、GCGGCCGCを認識)を使用した時に、あとから調べたら切断するDNAの制限酵素サイトの末端のGが欠損して

いることに気付きました。でも泳動の結果を見る限りではちゃんと切れているようだったので少し不思議に思いました。よろしくお願いします。

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pag********さん

2011/8/1112:27:58

STAR活性というものがあります。

過剰な酵素、不適切なバッファー、長時間の処理により、間違った配列をきってしまうことです。

しかし、泳動結果が適切なバンドの位置だったなら、その可能性は低いですね。でも、ないことはないです。

もしかしてDNAの保存が不適切で変異が入ったのでは?

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ID非公開さん

編集あり2011/8/1113:43:15

条件が最適なら(endogeneous なものに近ければ)ほぼ完全に正確(厳密)に認識します。
star は主としてバッファー系が最適化されていない場合に出ますが、Not I は比較的 star は出にくいです。H buff 以外でも20%以下だったと思います(star の場合、NCNNCCCNC 認識になります)。star の可能性も捨て切れませんが buffer があっていて、しかも他の消化産物が認められていなければ、他の要因と思われます。
もし、認識部位が厳密でなければ、CGGCCGの6塩基で同一配列認識に Eco52I があるので(まあ NotI より高いですが)、8塩基認識の酵素を使う意味が無いです(NotI は認識配列が長く sringency が高いので MCS に入れられようになりました。20年以上前は8塩基認識の酵素は入手できなかったので、 Not の使用は比較的新しい。当時は画期的でした)。
従って、G 欠損は考えにくいのですが・・・。sequencing で確認されたのでしょうか?

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