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サブクローニングで挿入したインサートが全て逆向きで困っています。 初めまし...

dha********さん

2017/5/1600:18:03

サブクローニングで挿入したインサートが全て逆向きで困っています。

初めまして、ご覧いただきありがとうございます。

insert配列を含むプラスミドを鋳型に、PCRでXho1サイトを5'側と3'側に付加
→ 精製してXho1で制限酵素処理 (vectorはBAP処理)
→ ゲルからの切り出し
→ ligationして大腸菌に導入
(insert無しのコントロールでは3個、有りでは8個のコロニーを得ました)
→ miniprepでDNAを抽出し制限酵素でinsertの存在と向きを確認
という手順を踏みましたが、コロニー8個中8個で、insert逆向き挿入時に予想される位置にバンドが確認されました。
用いた制限酵素はXho1のみですが、事情により他の制限酵素を使うことができません。

また、insertの遺伝子は4F2hcというアミノ酸輸送に関わる膜タンパク質の遺伝子なので、発現してしまったとしても、大腸菌にとってそんなに毒性があるとも思えず…

浅い経験ながら何度か一種類の制限酵素によるクローニングはやりましたが、すべて逆だったのは初めてで困惑しています。
得られたコロニー数が少なかったので、とりあえずもう一度播きなおす予定です。
他に何か追加で試すべきことがあればご助言よろしくお願い致します。

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h_e********さん

2017/5/1612:59:49

leakyに発現してしまって毒性を示しているんでしょう。よくあることです。
発現しても毒性があるとは思えないとおっしゃりますが、一般に外来性の膜タンパク質は大腸菌にとって毒で、多くの場合致死、可溶性ではなく封入体としてなら生きて発現させることができるというのが普通です。

ベクターはなんですか。クローニングの目的は?(ただのDNA断片のクローニング?形質導入、形質転換のためのコンストラクト? タンパク質大量発現用?)

それによって対処の方法が違ってくると思います。タンパク質大量発現用が目的だったりすると、根本から考え直す必要が出来てます(だって発現したら死んじゃうんだもの)。

pUC oriのベクターであれば、温度を25-30℃に下げることでコピー数が1/10位に減り、毒性を下げることが出来る場合があります。形質転換後のプレート培養を室温でやり、2-3 o/nくらいに出てきたコロニーを拾ってみます。液体培養をする場合も温度を低くします。
最初からコピー数の少ないベクターに乗り換えるのも手です(pBR系など)。

lac オペロン系が関わるベクターなら(青白選択のLacZサイトにクローニングしているとか、大量発現系でlacオペロンを利用しているとか)、培地にグルコースを加えることでleakyな発現を抑制することが期待できます。
もし青白選択をかける系を使っていて、IPTGの誘導をかけたり、DH5αなどlacオペロンの抑制がかからない宿主を使っているなら、やめましょう。


毒性タンパク質の発現に強い(致死になりにくい)、発現用宿主があります(C41, C43など)。クローニング用にも使えないことはないので(ただし、Rec+)、試す価値はあります。

  • h_e********さん

    2017/5/1613:20:49

    膜タンパク質だから毒性を発揮するというより、膜貫通領域のような疎水性アミノ酸のクラスターがあるとダメということらしい。

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kos********さん

2017/5/2115:20:44

そもそも大腸菌の中でタンパク質を発現させるためのプラスミドなんですか?

mic********さん

2017/5/1601:30:41

8個くらいなら運悪く全て逆向きということもあるかもしれませんね。
膜タンパクということですが、シグナルペプチドは除いていますか?シグナルペプチドが付いたままだと生育阻害を起こすことがあります。

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