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遺伝子系の研究室に入ってから、毎日実験をしています。大学生です。

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ID非公開さん

2019/9/2909:21:37

遺伝子系の研究室に入ってから、毎日実験をしています。大学生です。

制限酵素処理でDNAが切断できない状況に陥っています。どうか知恵をお貸しください。
ゲノムDNAは、液体培地で培養後チューブに入れ遠心分離し、沈殿した菌体にアルカリSDS法のsolution1を200μl、ProtationaseKを1μl、2%SDSを200μlを加え、99.5%エタノール800μlを加えて、目視できるようになったゲノムを少量巻き取り静置で乾燥しました。

これに超純水100mLを加え溶解し(均一にはなりません)、DNase不活化のために60℃,1時間のインキュベート。
少し冷ましてから制限酵素処理を行います。

制限酵素はBamHI-HF、bufferはcutsmartです。全部で100μlの、超純水75μl、buffer10μl、先ほどのDNA10μl、制限酵素5μlの順でチューブに加えます。
37℃で30分、1時間、1時間半、2時間のインキュベートを行いました。インキュベート中に何度か指でタッピングをしました。

その後Sampleを15μlとり電気泳動しますが、レーン全体にスメアが広がるか、ゲノムが少ないのかバンドが出てこない、となります。

このようになる原因と、その解決策をお教えください。よろしくお願いします。

教授には制限酵素処理の時間を長くする、温度を上げるというアドバイスを頂きましたが、これも、温度と時間の目安が分かればよろしくお願いします。

補足皆さま、ご回答いただきありがとうございます。
スメアが制限酵素処理の成功を意味していると教官にも言われました。
私も成功したと考え、切断したサンプルをアガロースゲルに流し、レーンを10等分しチューブに入れ、ゲルを凍らせました。
このゲルを室温で溶解し遠心分離させ、10等分したゲルのそれぞれの上清を用いて、BamHI認識部位を挟むPCRを行いましたところ、10等分全てのゲルで一本のバンドが現れ、BamHIで切れていないということがわかりました。

引き続き、よろしくお願い致します。

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h_e********さん

2019/9/2911:26:23

>レーン全体にスメアが広がるか、

ゲノムDNAを制限酵素消化した時の典型的なパターンだと思いますけど。
多様な鎖長のDNAの混合物になりますから。

どういう泳動像を期待しているのでしょうか?

バンドが見えないのは、反応液に入れたDNA溶液にDNAが十分に含まれていないせいかもしれません。
高分子量、高濃度のDNAを扱うのにはコツがいります。

溶解しにくい、均一な溶液になりにくい。粘性が高い。
DNAが均一に分散していなくて、ピペットで吸いやすい、DNAが含まれていなくて粘性の低い部分を分取しているのかもしれない。
ピペットチップの先端を切り落として口径を大きくして使う。粘性が高くても吸うことができ、また細い穴を通った時にDNAが物理的にせん断させるのを防げる。

DNAの溶媒を可能な限り多くして、濃度を下げる。
溶媒は水でなくTEなどのバッファーにする。DNA自体弱酸なので水だと酸性化して溶けにくくなる。DNAの沈殿はニ価金属イオンと複合体になって溶解性を下げていることがあるのでEDTAは有効。ダウンストリームの実験へのEDTA の持ち込みは通常問題ないレベル(どうしてもというなら抜いてもいい)。
高分子量DNAはすぐには溶けないので時間をかける(例えば一晩以上)。70度位まで加温する。

  • h_e********さん

    2019/9/2921:37:05

    > このゲルを室温で溶解し遠心分離させ、10等分したゲルのそれぞれの上清を用いて、BamHI認識部位を挟むPCRを行いましたところ、10等分全てのゲルで一本のバンドが現れ、BamHIで切れていないということがわかりました。

    これは無理筋。
    極端な話、一分子でも切れていないDNAが残ってたらPCRはかかります。
    一反応に入る分子数が正確になんぼあるかわかりませんが、10の数乗はあるはずです。
    それら全てを一つ残らず消化するというのは無理ってもんじゃないですか?
    そのレベルまで求められる実験なんでしょうか?

    あるいは未消化DNAをコントロールするにして同じくらいのCt値だったら制限酵素が効いていないと結論できるかもしれませんが。

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ken********さん

2019/10/118:28:09

まずはDNAのグレードが悪すぎる。そもそもなんの目的で菌のゲノムを消化しているの?

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ple********さん

2019/9/2910:43:34

その細菌のゲノムDNAはBamHIで切断した際に、泳動してスメアに見える程度にしかBamHI切断部位を持たないということはないでしょうか。また細菌の種類によっては、配列上ある制限酵素切断部位がゲノムの修飾により切れなくなっている場合もあります。切れという指示が出ているからには、そんなことはないと思いますが。

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mad********さん

2019/9/2909:59:27

書かれている方法で制限酵素処理ができるという文献はあるのでしょうか。ないなら、その菌株での実績のあるプロトコルやキットを調べることをお勧めします。

ゲノムを巻き取った後、乾燥させる前に、70%エタノールで洗うと、SDS等の持ち込みが減り、制限酵素の阻害物質が減ることが期待されます

DNAを溶かす溶媒が超純水というのはあまり見ませんが、それが妥当であることは文献で確認できているのでしょうか

スメアの場合と検出されない場合があるなら、そもそもサンプルが不均一と考えられます。TEで一晩かけて溶かす方が結果が安定するかもしれません。(あなたはEDTAの持ち込みを気にするかもしれませんが、他のBamHI用バッファの組成から、MgとEDTAの濃度比を計算してみれば、影響の程度を予想できるでしょう)

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ムスカさん

2019/9/2909:42:03

酵素のカタログは見ましたか?
反応温度は30℃、overnightで一度試すと良いと思います。
また、proteinaseKの不活性化はしましたか?95℃で10分インキュベートして酵素の不活性化を行うと良いです。
あとは、DNA量が多すぎても少なすぎても電気泳動でうまく流れないことがあるので流す量をいろいろ変えてみると良いでしょう
これだけやって駄目なら制限酵素の種類を変えるしかないです

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