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遺伝子操作に関する質問です。

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ID非公開さん

2019/10/1011:37:53

遺伝子操作に関する質問です。

ある遺伝子を破壊株に入れて相補株を作成したいのですが、プラスミド作りのところでつまづいています。

インサートをベクターにエレクトロポレーションで導入し、青白選択を行ったところ、しっかりと白いコロニーが得られます。
しかし、コロニーPCRでチェックするとインサートが目的のサイズより1〜2kb短くなってしまいます。

プラスミドの製作はin fusionで行おうと思っていて、ベクターはベクターゲノムからインバースで上げたものを使用しています。

ベクターのせいかと思い、プライマーを作り直して違うベクターを用いてやってみましたが同じ状況です、、

打開策があればご教授ください。

いろいろ試してみたいと思います、

補足インサート:ベクター=3:1でやってます。
1:1でやると青コロニーしか取れませんが、上の比率でやると白コロニー取れます。

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カテゴリマスター

2019/10/1011:52:36

最初に発現させずにクローニング可能かを試されてはいかがでしょうか。

青白選択ということはlacZ選択ですよね。

最初から発現させるように組まれているとその遺伝子が大腸菌に対して毒性があるのかどうかがわかりません。

だからまずはTAクローニングで、しかも表裏反対に入れて発現させないようにされてはいかがでしょうか。pUCシーズ、pBluescriptシリーズのようにプロモーターに対して反対の方向に入れられるシリーズもあります。クローン化可能かどうかを確かめられた後に、簡単な制限酵素処理の組み換えで発現させるようにされればいろいろとトラブルシューティングができるようになります。

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    質問者

    ID非公開さん

    2019/10/1013:03:53

    一応インサートはlacプロモーターと反対方向に入れて影響出ないようにしています、、、

    質問なのですが、大腸菌への毒性というのはどういうものでしょうか?一応普通に生えるので気になりました

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カテゴリマスター

mad********さん

2019/10/1013:45:22

まずはインサート配列を読むことをお勧めします

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