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大腸菌の形質転換の実験で 振とう培養する理由を教えてください。

ban********さん

2019/11/722:36:22

大腸菌の形質転換の実験で
振とう培養する理由を教えてください。

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2019/11/1005:06:56

一般的な大腸菌の形質転換では3回振盪培養がステップがありますよね。

一回目はプレート上で培養されている大腸菌を釣り上げて小容量Yの液体培地で一昼夜培養をする時。この時は必ずしも振盪する必要がなくてただ一晩である一定の濁度まで細菌が増えれば大丈夫です。

二回目はこの培養液を種にして対数増殖させる時。この時は振盪培養は必須です。
0.005 A600nmぐらいから培養を初めて0.5 A600nmぐらいまで振盪培養します。大腸菌は振盪培養をしてあげると栄養と酸素がくまなく全体に行き渡って栄養不足で細菌の一部が死ぬことなく増殖して2倍、2倍と約30分ごとに増える対数増殖をします。この健康的な体にしておいてあげれば、細菌の細胞膜を痛めてDNAを入れるという作業の時、大腸菌が生き残りやすく、その後の体の修復もよいのです。

市販のコンピテント細胞はDNAが導入できるようにしたこの状態で凍らせてとって置くようになっています。

三回目の振盪培養はDNAをその細菌に導入してからです。電気的に膜に孔を開けたり、科学的に膜を不安定化して本来水っぽいDNAが脂っぽい膜を通過できないところを無理やり通してあげます。ただそのままの状態でしたら細菌は死にますから、DNAが一旦取り込まれたら今度は大腸菌が体を素早く修復できるようにしてあげます。培養液を加えて生長させて体を修復させます。
この時に栄養がくまなく行き渡るように振盪培養するのが普通です。

でも器具がないとかで振盪培養ができない場合は必ずしも振盪培養する必要はないです。通常数倍だけ形質転換効率が下がるので数倍DNAを入れればよいだけのことなのです。

DNA導入後の液体培養すら飛ばすことがあります。この場合、100~1000倍ほど形質転換効率が下がりますけれど、単にプラスミドを大腸菌に入れるだけの作業の際にはたとえCaCl2法で10^5 CFU/μgプラスミドぐらいでも0.1μgもあれば100ぐらいはコロニーが出ますので用を足します。

どうでしょうか。

これで形質転換に必要な三回の振盪培養の目的とどのくらい必要かが理解できましたでしょうか。
(**^▽^**)

ちなみに大腸菌は通性嫌気性菌といって酸素があると呼吸ができる細菌ですけれど、必ずしも酸素を必要としません。大腸菌は酸素があれば早く生えてしかも培地があまり酸性にならずにすみます。だから普通は振盪培養する時に蓋をゆるゆるにしたり完全密閉しないようにして振盪培養してあげます。これも形質転換効率が良くなるだけで必須というわけではありません。

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h_e********さん

2019/11/1210:12:43

ヒートショックや電圧印加のあとの「回復培養」のことだと思います。
このときの振とうははっきり言って「おまじない」です。
振盪しなくても結果は大差ありません。
選択薬剤がタンパク質合成阻害剤(カナマイシン、クロラムフェニコールなど)でなく、アンピシリンなどの場合、回復培養そのものが必須ではありません。

nsn56ydyさん

2019/11/817:15:08

振とうさせて液体培地に空気を送り込むためと、大腸菌を攪拌させるためです

振とうせずに置いておくと1日くらいなら大して変化ないですが2日目くらいから死んだ細胞が試験管の底に溜まってきます(白いモヤみたいなものがそこに溜まってくる)

振とうしてても試験管の口を密閉するとエアレーションが落ちて大腸菌も元気がなくなってきます

ple********さん

2019/11/723:27:14

遺伝子導入後の振とう培養のことでしょうか?それなら、ヒートショックや高電圧パルスによる細胞のダメージを回復させるためと教わりました。そのため、通常培養するときよりもゆっくり振とうします。

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