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環境サンプルからDNAを抽出し、その中に存在する細菌の16S rRNA遺伝子をnested PCR...

man********さん

2020/1/2312:30:33

環境サンプルからDNAを抽出し、その中に存在する細菌の16S rRNA遺伝子をnested PCR(ほぼ全長の増幅 → V3領域の増幅)で増幅し、細菌群集の多様性を調べようとしています。

nested PCR での 1st-PCR でちょっと困っておりまして、皆さまのお知恵をお借りしたく、投稿した次第です。

通常TaqのPCRキットでの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動で約1.5kbのあたりにバンドが出るのですが、サイクル数を40回にしても増幅量は少ないです。

そこで、クルードサンプルにも対応したPCRキットを用いたところ、サイクル数を30回にしてもかなりの量の増幅が確認できました。
ただ、ここで頭を悩ますこととが発生しました。
約1.2kbくらいのあたりにも明瞭なバンドが出るようになり、その量は約1.5kbのバンドと同程度くらいあるのです。

通常Taqの 1st-PCR でも、約1.2kbあたりのバンドが出るサンプルと出ないサンプルがあるのですが、増幅量は明らかに約1.5kbのバンドよりは少ないです。

念のため、クルードサンプル用のキットでの増幅産物で確認された両方のバンドを切り出して、それぞれを 2nd-PCR に供したところ、アガロースゲル電気泳動で両方とも同じサイズのバンドを確認しました。
両方のバンドを含む 1st-PCR産物の 2nd-PCRでも、同じサイズのバンドを確認しています。
ちなみに、2nd-PCR産物を用いた群集解析は、まだ行っていません。

まずは、これら 2nd-PCR産物の群集解析を行わなければならないと思っているのですが、上記のように、PCRの結果が微妙に異なるキットのどちらを使うべきなのか、アドバイスいただけませんでしょうか。

通常Taqの場合、おそらく PCR阻害物質が完全に除去されていないことが影響して増幅量が少ないのだと思いますが、クルードサンプル用キットでは阻害物質の影響を受けていないとしても、約1.2kbのバンドが増幅されることが気になります。
クルードサンプル用キットでの 1st-PCRで、サイクル数が30回より少ない段階のものをいくつか調製し、両方のバンドの増幅具合を調べてみたいとも思っています。

プライマーは、大腸菌16Sの塩基位置では、63番目から1494番目を増幅するものなのですが、そのようなプライマーで約1.2kbしか増幅されない細菌がいるのでしょうか。
GGRNAサイトで、これらのプライマーで増幅される細菌を検索しても、ヒット数が多すぎて調べきれない状態です。

良いアドバイスをいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。

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ベストアンサーに選ばれた回答

gem********さん

2020/1/2509:16:37

2nd-PCRで同じサイズの増幅産物が
得られたのであれば問題ないと思います。
気になるなら、切り出したバンドから
得られた2nd-PCR産物を比較してみれば
いかがでしょうか?

  • 質問者

    man********さん

    2020/1/2919:22:34

    やはりそうですよね。

    まずは2nd-PCR産物の比較を行いたいと思います。

    16Sと相同性が高く、若干短い配列もあるのか否かは.....もう少し調べてみることにします。

    ありがとうございました。

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質問した人からのコメント

2020/1/29 19:24:26

ご指摘のように、2nd-PCR産物の比較を進めたいと思います。

ありがとうございました。

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