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プラスミドに入ったインサートDNAが同じ制限酵素で切断して取り出せなくなるのはど...

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ID非公開さん

2020/2/1515:55:00

プラスミドに入ったインサートDNAが同じ制限酵素で切断して取り出せなくなるのはどんなときですか?

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2020/2/1604:01:16

同じ制限酵素で切断して入れて切り出せるはずなのに切れ出せない・・・

たまにありますよね(**^_^**;;)

同じ制限酵素で処理してもライゲーション後が切断可能な配列にならなければ切り出すことができません。でも、たぶん質問者様の質問で聞きたいのは「切断した制限酵素部位と同じ配列が再生されるはずにも関わらず再切断が行かない!どうして、どうして」ですよね?違いますか。

その場合はいくつかの可能性があります。

1つはライゲーションがうまくいっていなかった場合です。

ヒントは組み換え体プラスミドのコロニーにあります。もしもコロニー数が少ない場合はライゲーションそのものがうまくいっていません。特にPCR断片を利用して制限酵素切断部位が末端付近にある場合によくあります。というのは末端まで二本鎖になっていなかったり、末端に近すぎて制限酵素がきちんと結合できずに活性がフルに発揮できない場合があるからです。この場合、改善策としては制限酵素切断部位を末端から離すように余分な5'の配列をプライマーに導入することが解決方法となります。そしてPCRは4℃で止めるのではなくて、質問で止める。そうすると末端のアニールが完璧にできます。でも遺伝子組み換えに不慣れな人の場合、それでも組み換え効率が低くなることがあります。その場合はまずTAクローニングをしてきちんと制限酵素が切断できるようにしてからサブクローニングをします。急がば回れ、です。

もちろん他の要因もありえます。

T4リガーゼ反応がうまく行っていない場合もありえます。この場合、コントロールの同じ制限酵素切断断片でも極端に組み換え体のコロニー数が少なくなります。改善策は制限酵素やATPの入っている反応液の保存管理の徹底です。

ライゲーション反応がうまく行き過ぎるのも制限酵素切断部位がなくなっちゃう原因になります。
ライゲーション効率のいいライゲーションキットのT4リガーゼ反応液にはPEGが入っています。これで反応を促進しています。でもこれでたとえ突出末端が相補していなくてもつながってしまうことが置きます。そのため、大腸菌に導入された時に大腸菌が遺伝子修復をしたけっか、制限酵素切断部位に当たる配列が削れたり、余分な配列が入ることで制限酵素切断部位が壊れることがあります。

これがまず1つ目です。つまりライゲーションと形質転換、PCRなどの問題です。

もう一つ目は遺伝子そのもののせいであることがあります。

もしもその遺伝子が組み込まれると大腸菌にとって毒性がある場合、たとえばキナーゼやプロテアーゼのような酵素の遺伝子あった場合は弱い発現条件でも大腸菌の生育を妨げたり、殺してしまったりして正しくライゲートできていたのに形質転換株が得られないことがあります。そのために制限酵素部位が破壊されて読み枠ズレを起こしたマイナーなクローンをひろちゃった、というケースです。

この場合の解決策はもしもそのベクターがlac/tacPOなどを持っていた場合は反対向きに入れてみる、です。pUC18ならpUC19を、pBluescriptSKならpBluescriptKSを使ってみる、です。

もう1つの解決策は自分がサテライトコロニーと思っていた小さなkコロニーも拾って組み換え体か調べてみる、です。これもたまにあります。インサートが毒性があるのでコロニーが小さくなっちゃった、です。たまにあって驚くのはたとえ大腸菌のプロモータが上流になくてもインサートが毒性を示すことがあります。だから、理屈でそんなはずがない、という偏見を捨てて試しに小さなコロニーのクローンもダメ元で試してみましょう。

このアドバイスが実験にお役に立てることを祈っています。
がんばって!
(**^ ▽ ^**)

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charlie04hfさん

2020/2/1517:13:17

質問者様のお聞きになっているのは、異なった二種類の制限酵素で
切断された DNA 断片をライゲーションしたために、それらの
制限酵素で認識される配列ではなくなる、ということでしょうか?

(以下、...は位置合わせのためのものです。空白だと思って下さい。)
例えば、Bam HI の認識部位
-G↓GATC...C- → -G............GATCC-
-C...CTAG↑G- → -CCTAG + .......G-
と、Bgl II の認識部位
-A↓GATC...T- → -A...........GATCT-
-T...CTAG↑A- → -TCTAG + .......A-
で切断されたものをライゲーションすると、
-GGATCT- ... -AGATCC-
-CCTAGA- か -TCTAGG- という二本鎖の配列となり、
この場合新たに生成した配列では Bam HI でも Bgl II でも認識されず
切断できなくなる、ということになりますね。

h_e********さん

2020/2/1516:00:00

もっと具体的に。
インサートはどうやって調製したものか(他のベクターから切り出し? PCR? ゲノムDNA(プラスミドライブラリー)?)

制限酵素の種類も関係してくるから、具体的な酵素名を挙げてほしい。

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mad********さん

2020/2/1515:58:17

制限酵素認識サイトが無くなった時

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