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PCRがかからなくなりました。原因は、プライマーということはわかりました。

akb********さん

2013/8/2615:08:03

PCRがかからなくなりました。原因は、プライマーということはわかりました。

プライマーは、希釈したものをつかっており、それがある日おかしくなり(電気泳動結果より)ストックを再び希釈しましたが、やっぱりPCRがうまくいきません。
質問なのですが、プライマーが失活することってありますか?(融解はタッピングしてます)

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cof********さん

2013/8/2615:21:04

プライマーは酵素ではないので失活という言葉は適切ではないですが、分解してしまうことはあります。

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aka********さん

2013/8/2622:09:54

>融解はタッピングしてます
pulse vortex & spin down の方が均一な液になるのではないでしょうか?



ところで、primerのstock solutionそのものに「問題が無い」ことは確認できているのですか?
そもそも、stockに潜在していた問題が先に希釈した溶液で顕在化しただけで、stockの方でも同じ問題が生じていた、という事はありませんか?

また、PCRがかからなくなった原因は、primerの問題「だけ」なのですか?
複数の要因が併発していて、primer以外にもまだ問題が残っている可能性はないのですか?

それこそ、「水」がnuclease contaminationを起こしているとか、DNA polymeraseが失活しているとか、
溶液(PCR Buffer)を融かした後の混和の仕方が普段から不十分だった結果として、回数を重ねるうちに溶液の組成が徐々に変化していったとか…

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h_e********さん

2013/8/2617:23:34

分解もありえますが、吸着ロスも大きな要因です。
吸着ロスも分解と同様、希釈された状態だと起こりやすいです。

ストック溶液は10 mMくらいのTEあるいはTris buff (pH 8.0)程度にしておいたほうがいいです。PCRへのバッファー成分の持ち込みを嫌って、純水に溶かす主義の人もいますが、圧倒的にへたりやすいです。

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