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生物学 分子生物学 遺伝子 今読んでいる論文の、遺伝子のクローニングと組換え...

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ID非公開さん

2019/5/111:58:14

生物学 分子生物学 遺伝子

今読んでいる論文の、遺伝子のクローニングと組換え発現方法について書かれている部分に、

The gene was PCR-amplified and cloned into the vector pFastBac, which confers an N-terminal His6-tag followed by a tabacco etch virus protease recognition site on the expressed protein.

と書いてあります。これはどういう意味ですか?
この手の実験はしたことがないので基礎知識が欠けています。
これは制限酵素でDNAとベクターを処理した過程が省略されている感じですか?
また、タグに関してもほとんど無知なので、どういう理由でTEVプロテアーゼが出てきたのか分かりません(どういう働き?)。
どなたかわかりやすく解説して頂けたらありがたいです。
よろしくお願いいたします。

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ieo********さん

2019/5/112:08:21

簡単な話ですね。何かを鋳型にPCRをして特定遺伝子のcDNAを増幅、その断片をpFastBacというベクターに入れただけ。そのcDNAの上流にはポリヒスチジンタグがついていて、下流のcDNAがコードするタンパク質との融合タンパク質として発現させられる。必要に応じてタグの下流にあるTEV認識配列を使って、ヒスチジンタグを切り離すことができる。

  • ieo********さん

    2019/5/112:10:23

    タグは抗体で検出しやすいようにするため、あるいは精製のために使われます。ヒスチジンタグタンパク質をどうやって精製するのかは自分で勉強してください。

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h_e********さん

2019/5/112:15:03

いまやベクターにインサートを入れる手技は当たり前の技術だし、やり方がどうであれちゃんとコンストラクトができればいいのでなので、単にwas clonedとしか書いていないんでしょう。違和感ないです。ちなみに今や制限酵素消化とライゲーションが唯一の選択肢でもない。ゲートウェイとかギブソンアッセンブリなんかを使うほうがトレンド。

Hisタグ、プロテアーゼ認識配列は目的の遺伝子のリーディングフレームにインフレームで融合させてあります。発現したタンパク質を単離精製するためにHisタグが利用されています。ヒスチジンが銅や亜鉛に配位結合する性質を利用して金属イオンを固定し担体で融合タンパク質だけくっつけて単離します。
タグを付けたままのタンパク質でできる実験ならそのまま使えますが、余計は配列が付加されていない目的のタンパク質だけがほしいときはTEVプロテアーゼで切り離せるようにそのプロテアーゼの標的配列を入れてあります。

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