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タンパク質の可溶化について

d14********さん

2010/6/1418:28:51

タンパク質の可溶化について

こんにちは。このたび、大腸菌でとあるタンパク質ドメインの発現コンストラクトを構築することになりました。

BL21にインサートを入れたpETvectorを導入し、形質転換しました。N末端側にHis-tagを付加させていますが、融合タンパクはありません。

これを37度で培養し、OD600=0.5になったらIPTGを0.1mMになるように加え、15℃で65hほど培養しました。
次に菌体を回収し、BugBusterを用いて可溶化させたところ、目的のタンパクは全て不溶性画分に移行しており、可溶性画分には目的のタンパクがありませんでした。確認はSDS-PAGEで行いました。目的と思われるバンドがかなり太く出現しており、分子量からも目的のタンパクだと思います。

可溶性画分に目的のタンパクを得るにはさらにIPTG濃度を下げる方法がベストでしょうか?もしくは、可溶化のさい、界面活性剤を添加するべきでしょうか?リフォールディングは分子量が25kDaちょっとなので、無理だと思います。
現在、融合タンパクを付加させた発現系も考えています。なにか他に改善点がありましたら、ぜひアドバイスのほど、よろしくお願いします。

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sho********さん

2010/6/1420:18:11

大きさからいっても、十分精製可能な範囲ですね。前の回答者様の通りでいいと思います。
もし、私がやるのであれば・・・ですが、
GSTに融合させた方が可溶化しやすいというのはあるようです。大きさからいっても、fusionさせても十分精製可能な範囲だと思います。
なお、不溶性画分に移行してしまう理由が、本来SS結合が必要なのに、されていないというのであれば、origamiなどの大腸菌ですと、場合により劇的に収量が増えるようです。私は使ったことが無いので、詳細は申し上げられませんが・・・。
なお、IPTGはそのままの濃度でかまわないと思います。添加後に温度を下げて培養するのは、一気に誘導してしまうと大腸菌に異物として認識されてしまうことがあり、これにより収量が下がってしまうのを防ぐために行っていることです。一度異物として認識されてしまうと、全てが封入体に入ってしまうことが多く、培養時間は短い方が収量が多いこともあります。
特別に失活しやすい場合を除いて、多少の界面活性剤は入れてもいいと思います。私は、グリセロール(final 5%)も入れており、これにより精製時のデブリスや不活化も防げていると思います。

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leo********さん

2010/6/1420:28:20

上記の内容を見ますと,まだまだ検討する余地はあると思います。温度・IPTGの濃度やアプライするタイミング(時間)など手当たり次第やればいいと思います。私の場合,LB液体培地(2×YT培地だったかもしれませんが)5CCをファルコンチュウーブに入れ,少量での条件検討を行いました。そのあと超音波破砕したのち上精と沈澱物をSDSページで確認しました。ちなみに私はヒスタグよりGSTのタグタンパクがすきです。
実験いいですね。頑張って下さい。

jim********さん

2010/6/1419:25:18

温度(低温)、培養組成、大腸菌の種類の組み合わせで検討します。IPTG誘導後もサンプリングしながら、時間を調整。
リフォールディングも無理な大きさじゃないと思います。

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