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qPCRデータのまとめ方が分かりません。(2)

bak********さん

2011/6/112:46:03

qPCRデータのまとめ方が分かりません。(2)

2種のチューブ内に存在する菌体の量を、その菌体のDNA量で比較したく、qPCRによって定量しようとしています。
あるサンプルのCt値が28,27,26,22,22の5つのデータがあり、もう一つのサンプルのCt値が30,30,29,29,30の5つのデータがあります。
この二つのデータ群より、2データ群の間のDNA存在比を平均±標準偏差で求めたいのですが、どのように計算するのが正しいでしょうか。
2^(Ctの平均値の差)がDNA量の差であるため、2種チューブ内のDNA量差を比較することは出来ますが、これにSDを付けるにはどう計算すれば良いのでしょうか??

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zui********さん

2011/6/118:37:22

比較Ct法(⊿⊿Ct法)を行いたいと言うことですよね.比較Ct法では,

⊿Ct=ターゲット遺伝子Ct-内在性コントロールCt(チューブ毎の値で算出)
⊿⊿C=各サンプル⊿Ct-基準サンプルの平均⊿Ct
得られた⊿⊿Ctを2^(-⊿⊿Ct)にあてはめてコピー数の比較を行う

の3つの計算を行って比較します.この最初の式からもわかりますが,各チューブ内の初期遺伝子量の補正のために,内在性コントロール(検量線サンプルではありません)が必要です.そのことは承知の上で,計算方法についての質問とお見受けしました.

ではまず,計算方法を説明する前に,書いてあるデータは,AとBの二種類のサンプルからreplicate(繰り返し測定)を5として測定したところ,Aからは「28, 27, 26, 22, 22」,Bからは「30, 30, 29, 29, 30」のデータが得られとの理解で進めさせていただきます.また,比較Ct法のように計算するとなれば,基準がどちらかを決める必要がありますので,サンプルAを基準とすします.その場合,計算手順は以下の通りとなります.

①Aの個別値から平均を求めます.(28+27+26+22+22)/5 = 25

②AとBそれぞれの各データと①で求めた平均値との差を求めます.Aからは,{3, 2, 1, -3, -3},Bからは{-5, -5, -4, -4, -5}

③②で求めたAとBからのそれぞれの値について平均と標準偏差を算出.Aからmean=0.0,S.D.=2.8,Bからはmean=-4.6,S.D.=0.5が求まります.

④この平均を⊿⊿Ctとして,2^(-⊿⊿Ct)にあてはめて,Aに対しての遺伝子量は,Aからは1.0 (0.14 - 7.1), Bから24.3 (16.6 - 35.5)です.カッコ内は信頼区間になります.何故このように信頼区間として書いたかは,お分かりだと思いますが,②で求めた標準偏差は,対数正規分布と用いて計算していることになりますので,これをコピー数にすると(真数に戻す),すでに正規分布していませんので,②の標準偏差は,信頼区間として[2^(-⊿⊿Ct-S.D.) - 2^(-⊿⊿Ct+S.D.)]に表さなければいけませんのでご注意下さい.

これは他でもなく,内在性コントロールのデータが無いので,得られた個々のデータを最初に書いた式の⊿Ctとして用いて行っっただけです.計算はこのようにして行えますが,どのように使うのかには気をつけて下さいね.

ご参考までに,見解には個人差があることを承知で書かせていただきますと,検量線法を用いたほうが精度が高いというメリットは確かにあります.しかし,精度高く定量するまでも無く比較するだけとか“あたりをつける”などの使い方ならばより簡便にできる比較Ct法のほうがメリットが多いかもしれません.また,“あたりをつける”試験のような場合ならば,さらに簡素にできるのならより簡素な系で行うほうが効率的かもしれません.要するに,データの取り方の違いで「データの価値」は変わりますが,同じデータの取り方でも「使い方次第」で有用にも無用にも或いは有害にも無害にもなるということです.お分かりかとは思いますが,気をつけてくださいね.長くなってしまいすいませんでした.

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knd********さん

2011/6/116:51:06

しつこくてすみませんが、
「2^(Ctの平均値の差)がDNA量の差」というのは「PRCで1サイクルでDNAが2倍にふえる」という仮定が成立する系において有効な式ですが、あくまでも理論上の仮定で、実際には1サイクルで正確に2倍ずつ増えることは殆どありません。
その式を用いて「菌体量の差」を出したとしても、それは信用になる値ではないです。

面倒でも、もう一度検量線用の希釈系列サンプル最低でも4点置いて実験し直すことをお勧めします。

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