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タンパク質発現について

ノロウイルスさん

2011/11/2122:02:56

タンパク質発現について

大腸菌によるタンパク質発現についての質問です。
pET21ベクターに目的の遺伝子をいれ、BL21株を用いてOD600=0.4を目安にIPTG誘導によりタンパク質発現の実験を行いました。
発現誘導の時間・温度などの条件もいくつか検討し、その後大腸菌を破砕してCBB染色でバンドを確認したところ、どの条件でも目的のバンドが確認できず、βガラクトシダーゼの位置(116kDa)にあたるバンドだけが、誘導をかけていないサンプル(コントロール)よりも量が多くなっていました。目的タンパクの分子量は150kDaです。
なぜ目的のバンドが確認できず、βガラクトシダーゼ(と思われる)バンドが多くなったのでしょうか??
ちなみにベクターにいれたインサートの配列は確認済みです。
原因となりうる事柄を詳しく教えてください。 タンパク質発現に関しては初心者です。
あと、発現誘導の時間・温度はどのようにすれば発現量が上がるのですか?

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cro********さん

2011/11/2208:35:44

βガラクトシダーゼはBL21のT7RNApolと同様にガラクトースにより誘導されます。なので、誘導はうまくいっているということです。

抗体があるならウエスタンで確認してみましょう。

わたしの経験上150kDaといった巨大タンパク質を大腸菌で効率よく発現するのは難しいケースが多いです。当然、いろいろな温度で時間経過とともに見ていると思いますので、画期的な改善は難しいと思います。

目的がわからないのでなんともいえませんが3つくらいの断片に分けるとかすれば、大量発現は達成できると思います。

質問した人からのコメント

2011/11/24 02:27:06

降参 回答ありがとうございます。
参考にさせて頂きます。

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h_e********さん

2011/11/2209:52:40

pET21で、本当にただのBL21を使ったのなら発現しません。T7 polymeraseの遺伝子が乗ったlambda(DE3)を持ったBL21(DE3)を使わなければなりません。

いずれにせよ大腸菌で融合タンパク質を発現させるのは100 kDa位が限度で、それもなかなか難しいです。

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